Kalkulator Ligacji

Kategoria: Biologia
- April 04, 2025
| |

DNA Wektora

DNA Wstawki

Ustawienia Reakcji Ligacji

Zalecana Ilość Wstawki
8.3 ng
0.33 μL roztworu wstawki
Ilość Wektora
50 ng
Używając 1 μL roztworu wektora
Stosunek Wstawka:Wektor
3:1 (molar)
Optymalne dla standardowego klonowania

Pełne Ustawienia Reakcji

Składnik Objętość (μL) Końcowa Ilość
DNA Wektora (50 ng/μL) 1.0 50 ng
DNA Wstawki (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
Bufor Ligazy DNA T4 10× 2.0 1×
Ligaza DNA T4 1.0 400 U
Woda wolna od nukleaz 15.67 Do 20 μL
Całkowita Objętość 20.0

Wskazówki Optymalizacyjne

Na podstawie wprowadzonych parametrów, oto kilka rekomendacji:

  • Dla końcówek 5' sticky przy stosunku wektor:wstawka 1:3, inkubować w 16°C przez 4 godziny.
  • Obróbka CIP wektora pomoże zredukować tło samoligacji.
  • Jeśli efektywność transformacji jest niska, spróbuj zwiększyć stosunek wstawka:wektor do 5:1.
  • Dla ligacji końców tępych, zwiększ stężenie ligazy i wydłuż czas ligacji.
  • Inaktywuj ligazę w 65°C przez 10 minut przed transformacją dla najlepszych wyników.

O Ligacji DNA

  • Ligacja DNA polega na łączeniu fragmentów DNA poprzez tworzenie wiązań fosfodiestrowych.
  • Ligaza DNA T4 wymaga ATP i Mg²⁺ do prawidłowego działania (dostarczane w buforze ligacyjnym).
  • Ligacje końców sticky są bardziej efektywne niż ligacje końców tępych.
  • Stosunki molowe wektor:wstawka zazwyczaj mieszczą się w zakresie od 1:3 do 1:5 dla standardowego klonowania.
  • Wyższe stosunki wstawka:wektor (3:1 do 10:1) są zalecane dla ligacji końców tępych lub większych wstawek.
  • Defozforylacja wektorów (przy użyciu CIP, SAP itp.) zapobiega samoligacji wektora.
  • Systemy szybkiej ligazy mogą skrócić czas ligacji do 5-15 minut w temperaturze pokojowej.

Wzór na ilość wstawki (ng):

\[ \text{Wstawka ng} = \left( \frac{\text{Wektor ng} \times \text{Rozmiar wstawki w kb}}{\text{Rozmiar wektora w kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Mole wstawki}}{\text{Mole wektora}} \right) \]

Czym jest Kalkulator Ligation?

Kalkulator Ligation to narzędzie, które pomaga badaczom określić odpowiednią ilość wektora i DNA wstawki potrzebną do udanej reakcji ligacji. Ligacja DNA jest kluczowym krokiem w klonowaniu molekularnym, gdzie wstawka DNA jest łączona z wektorem plazmidowym za pomocą enzymu zwanego ligazą DNA.

Jak to działa?

Ten kalkulator pozwala użytkownikom wprowadzać szczegóły dotyczące ich wektora i wstawki, w tym długość i stężenie. Na podstawie wybranego stosunku molowego oblicza wymaganą ilość DNA wstawki, aby osiągnąć optymalną reakcję ligacji.

Kluczowe cechy

  • Oblicza stosunki molowe wektora do wstawki dla różnych scenariuszy klonowania.
  • Obsługuje zarówno standardowe, jak i niestandardowe stosunki molowe.
  • Zapewnia zalecenia dotyczące warunków ligacji w zależności od klonowania z końcami lepkimi lub tępymi.
  • Zawiera wskazówki dotyczące optymalizacji w celu poprawy efektywności ligacji.

Jak korzystać z kalkulatora

  1. Wprowadź długość wektora (bp) i stężenie (ng/μL).
  2. Wprowadź długość wstawki (bp) i stężenie (ng/μL).
  3. Wybierz pożądany stosunek molowy wektora do wstawki (np. 1:3, 1:5).
  4. Określ całkowitą objętość reakcji (np. 20 μL).
  5. Dla zaawansowanych ustawień wybierz temperaturę ligacji, czas trwania, typ ligazy i opcje traktowania wektora.
  6. Kliknij „Oblicz”, aby wygenerować zalecaną ilość wstawki i konfigurację reakcji.

Najczęściej zadawane pytania

Jaki jest optymalny stosunek molowy wektora do wstawki?

Dla ligacji z końcami lepkimi zazwyczaj zaleca się stosunek 1:3 lub 1:5. Dla ligacji z końcami tępymi wyższy stosunek (np. 1:5 do 1:10) może poprawić efektywność.

Dlaczego zaleca się defosforylację wektora?

Defosforylacja (przy użyciu CIP, SAP lub fosfatazy antarktycznej) zapobiega samoligacji wektora, co zmniejsza niepożądane kolonie tła.

Jakie warunki ligacji powinienem zastosować?

  • 16°C przez 4 godziny – Standardowy warunek dla ligazy DNA T4.
  • Temperatura pokojowa przez 15 minut – Odpowiednie dla Quick Ligase.
  • Przez noc w 16°C – Zalecane dla trudnych ligacji lub klonowania z końcami tępymi.

Jak mogę poprawić efektywność ligacji?

  • Upewnij się, że stosunek molowy dla wektora i wstawki jest poprawny.
  • Użyj świeżej ligazy DNA i buforu.
  • Optymalizuj warunki ligacji (temperatura i czas trwania).
  • Potwierdź obecność wstawki za pomocą elektroforezy żelowej przed ligacją.

Dlaczego warto używać tego kalkulatora?

Ten Kalkulator Ligation upraszcza konfigurację reakcji ligacji DNA, pomagając badaczom określić odpowiednie ilości wektora i wstawki dla efektywnego klonowania. Automatyzując obliczenia i oferując wskazówki dotyczące optymalizacji, oszczędza czas i zwiększa wskaźnik sukcesu eksperymentów ligacyjnych.