Kalkulator Ligacji
Kategoria: Biologia
- March 24, 2025
|
|
DNA wektora
DNA inserta
Ustawienia reakcji ligacji
Zalecana ilość inserta
8.3 ng
0.33 μL roztworu inserta
Ilość wektora
50 ng
Użycie 1 μL roztworu wektora
Stosunek insert:wektor
3:1 (molowy)
Optymalny dla standardowego klonowania
Kompletne ustawienia reakcji
| Składnik | Objętość (μL) | Końcowa ilość |
|---|---|---|
| DNA wektora (50 ng/μL) | 1.0 | 50 ng |
| DNA inserta (25 ng/μL) | 0.33 | 8.3 ng |
| Bufor T4 DNA Ligase 10× | 2.0 | 1× |
| T4 DNA Ligase | 1.0 | 400 U |
| Woda wolna od nukleaz | 15.67 | Do 20 μL |
| Całkowita objętość | 20.0 |
Wskazówki optymalizacyjne
Na podstawie wprowadzonych parametrów, oto kilka zaleceń:
- Dla końców lepkich 5' przy stosunku wektor:insert 1:3, inkubuj w 16°C przez 4 godziny.
- Obróbka wektora CIP zmniejszy tło samoligacji.
- Jeśli wydajność transformacji jest niska, spróbuj zwiększyć stosunek insert:wektor do 5:1.
- Dla ligacji końców tępych zwiększ stężenie ligazy i wydłuż czas ligacji.
- Inaktywuj ligazę w 65°C przez 10 minut przed transformacją dla najlepszych wyników.
O ligacji DNA
- Ligacja DNA polega na łączeniu fragmentów DNA poprzez tworzenie wiązań fosfodiestrowych.
- T4 DNA ligase wymaga ATP i Mg²⁺ do prawidłowego działania (dostarczane w buforze ligacji).
- Ligacje końców lepkich są bardziej wydajne niż ligacje końców tępych.
- Stosunki molowe wektor:insert zazwyczaj mieszczą się w zakresie od 1:3 do 1:5 dla standardowego klonowania.
- Wyższe stosunki insert:wektor (3:1 do 10:1) są zalecane dla ligacji końców tępych lub większych insertów.
- Defosforylacja wektorów (przy użyciu CIP, SAP itp.) zapobiega samoligacji wektorów.
- Szybkie systemy ligacji mogą skrócić czas ligacji do 5-15 minut w temperaturze pokojowej.